بانک مقالات کشاورزی و باغبانی و گیاه پزشکی
بانک مقالات کشاورزی و باغبانی و گیاه پزشکی فارسی انگلیسی ترجمه
موضوعات مطالب
آمار و امكانات
:
:

دانلود ديكشنري كشاورزي مخصوص بابيلون

پشتیبانی سایت

 

لینک عضویت در کانال تلگرامی ما ضمنا برخی مقالات فقط در کانال ما موجود هستند حتما بازدید کنید.


پاییز  95  برشما عزیزان  تبریک و تهنیت باد



انتقال ژن در بهبود گياهان زراعي(۱)
ارسال شده توسط سیدمهدی شمس تاریخ ارسال : سه‌شنبه ۱۳۸٦/٤/۱٩

دسته مقاله : ژنتیک درگیاهان

 

چكيده
انتقال ژن يا جذب DNA فرايندي است كه قطعه مشخصي از DNA ( معمولاً يك ژن خارجي وارد شده در پلاسميد باكتريايي) را به درون سلول¬ها وارد مي¬نمايد. در اصلاح نباتات، تكنيك¬هاي مرتبط با انتقال ژن از طريق تكثير جنسي و رويشي به خوبي رايج مي¬باشند. هدف از اين تكنيك¬ها ايجاد تنوع ژنتيكي در جوامع گياهي، انتخاب گياهان برتر از نظر ژنهاي كنترل كننده صفات مطلوب و همچنين حفظ تنوع واريته¬هاي گياهي مي¬باشد. با استفاده از تكنيك¬هاي اصلاحي مرسوم، پيشرفت¬هاي چشم¬گيري در زمينه بهبود عملكرد گياهان زراعي حاصل شده است. معذالك اين تكنيك¬ها وقت¬گير هستند. در سالهاي اخير، بيوتكنولوژي گياهي منبعي سرشار از ابداع و خلاقيت بوده است و براي رفع مشكلات قديمي راه حل¬هاي نويني فراهم كرده است. بنابراين، در اين مقاله سعي شده است كه چشم¬انداز حال و آينده انتقال ژن را در بهبود گياهان زراعي مورد بررسي قرار دهد.
قدمه
دهها سال است كه انتقال ژن بين گونه¬هاي گياهي نقش مهمي در بهبود گياهان زراعي بازي كرده است. بهبود گياه چه در نتيجه انتخاب طبيعي و يا با تلاش¬هاي به¬نژادگران، هميشه بر اساس ظهور، ارزشيابي و گزينش تركيبات صحيح آلل¬ها بوده است. صفات مفيد از قبيل مقاومت به بيماري¬ها، حشرات و آفات از گياهان غير زراعي به واريته¬هاي گياهان زراعي منتقل شده است. از سال 1970، پيشرفت قابل ملاحظه¬اي در ابداع ابزارهاي لازم براي دستورزي اطلاعات ژنتيكي در گياهان توسط روش¬هاي DNA نوتركيب رخ داده است. فرايند كلي ترانسفورماسيون ژنتيكي شامل معرفي، تلفيق و بيان ژن يا ژن¬هاي خارجي در گياه پذيرنده است. گياهاني كه ژن¬هاي خارجي از منابع ژنتيكي ديگر را با خود حمل مي¬كنند و آنها را به صورت پايدار در خود جاي داده و بيان مي¬نمايند، گياهان تراريخت ناميده مي¬شوند. توليد گياهان تراريخت نتيجه كاربرد تلفيقي تكنولوژي rDNA، روش¬هاي انتقال ژن و تكنيك¬هاي كشت بافت مي¬باشد. با استفاده از اين تكنيك¬ها توليد گياهان تراريخت در محصولات غذايي- ليفي، سبزيجات و درختان ميوه و جنگلي ميسر شده است. در سالهاي اخير، بيوتكنولوژي گياهي منبعي سرشار از ابداع و خلاقيت بوده است و براي مشكلات قديمي راه حل¬هاي نويني فراهم كرده است. ژن¬هاي گياهي كلون مي¬شوند، علائم تنظيم كننده ژنتيكي رمز گشاي مي¬شوند و ژن¬ها از موجودات كاملاً غير خويشاوند ( خصوصا باكتريها و ويروسها) براي اعطاء صفات زراعي مفيد جديد، به گياهان زراعي منتقل مي¬شوند. ترانسفورماسيون ژنتيكي انتقال ژن¬هاي مطلوب ويژه را، بدون همراهي با هيچ ژن نامطلوبي از گونه¬هاي بخشنده به گياه زراعي ميسر ساخته است. در حاليكه در روش¬هاي اصلاحي مرسوم ژن¬هاي نامطلوب نيز همراه ژن¬هاي مطلوب منتقل مي¬شوند. پتانسيل وارد كردن و بيان ژنهاي خارجي گوناگون اولين بار در گياه توتون توسط اگروباكتريوم (De Block et al. 1984) و روش بدون استفاده از ناقل (Paszhowski et al. 1984) توصيف شده است. ليست گونه¬هاي گياهي كه مي¬توانند توسط ناقل آگروباكتريوم و روش بدون ناقل تراريخت شوند، به طور مداوم در حال رشد بوده و در حال حاضر توانايي تراريختي به بيش از 120 گونه گياهي و در حداقل 35 خانواده گسترش پيدا كرده است. موفقيت¬ها اغلب شامل محصولات مهم اقتصادي سبزيجات، گياهان زينتي، دارويي، درختان و گياهان مرتعي مي¬باشد. انتقال ژن و باززايي گياهان تراريخت، ديگر جزو فاكتورهاي محدود كننده در بهبود و كاربرد سيستم¬هاي ترانسفورماسيون عملي براي بسياري از گونه¬هاي گياهي نيستند. براي اين گفته، كافي است اشاره شود كه قبلاً گونه¬هاي تك لپه¬اي در خارج از حوزه ميزبانيA. tumefacims قرار مي¬گرفتند و اين امر منجر به ابداع انتقال مستقيم DNA يا روش بدون ناقل براي ترانسفورماسيون گرديد. معذالك اخيراً ترانسفورماسيون توسط آگروباكتريوم در گونه¬هاي تك لپه¬اي از قبيل گياهان غذايي مهم از جمله برنج (Hiei et al. 1994)، ذرت (Ishida et al. 1996) و گندم (Cheng et al. 1997) گزارش شده است.
اولين نسل كاربرد مهندسي ژنتيك در محصولات كشاورزي به سمت توليد گياهان تراريخت بيان كننده ژن خارجي براي مقاومت به ويروس¬ها، حشرات، علفكش¬ها يا عوامل فساد بعد از برداشت و تجمع فراورده¬هاي ذخيره¬اي تغييرشكل يافته مفيد بوده است. اين موضوعات تحت عناوين ذيل بحث شده¬اند.

مقاومت به تنشهاي زنده
ترانسفورماسيون ژنتيكي امكان ترانسفورم كردن گياهان براي بهبود مقاومت به حشرات و پاتوژنها را ميسر ساخته است و به سرعت به سمت تجاري شدن پيش مي¬رود. اين پيشرفت¬ها اساس راهكار اقتصاد پايدار و بدون استفاده از مواد شيمايي را براي كنترل آفات و بيماري¬ها تشكيل مي¬دهد. مقاومت به تنش¬هاي زنده تحت عناوين زير بحث شده¬اند.
1- مقاومت به حشرات
2- مقاومت به ويروسها
3- مقاومت به بيماريهاي قارچي و باكتريايي

1- مقاومت به حشرات
پيشرفت در مهندسي گياهان تراريخت براي مقاومت به حشره، از طريق استفاده از ژنهاي پروتئين كنترل كننده Bacillus thuringiensis حاصل شده است. مقاومت به حشره ابتدا در توتون (Vaeck et al. 1987) و گوجه فرنگي (Fischhoff et al. 1987) گزارش شد. امروزه ترانسژن مقاوم به حشره از هر منبعي از جمله گياهي، باكتريايي و يا منابع ديگر مي¬تواند به منظور افزايش سطح مقاومت به حشره، به گياهان منتقل شود. تقريباً 40 ژن متفاوت اهدا كننده مقاومت به حشره، به گياهان زراعي وارد شده است. ژنهاي اهدا كننده مقاومت گياهان به حشره از ميكروارگانيسمها بدست آمده است. ژن Bt از Bacillus thuringiensis، ژن ipt ايزوپنتيل ترانسفراز از Agrobacterium tumefacines، ژن كلسترول اكسيداز از قارچهاي استرپتومايسز و ژن pht از Photorhabdus luminescens. ژنهاي مقاوم از گياهان عالي مي¬تواند به دو گرو تقسيم شود (1) بازدارنده¬هاي پروتئيناز و آميلاز و (2) لكتين¬ها، لكتين گل حسرت (GNA)، لكتين نخود، لكتين برنج و غيره. ژن¬هاي مقاوم با منشاء حيواني بازدارنده¬هاي پروتئيناز سرين از پستانداران و كرم شاخدار توتون (Manduca sexta) مي¬باشد.

1-1- ژنهاي مقاوم از ميكروارگانيسمها
ژن توكسين Bt : Bacillus thuringiensis (Bt) باكتري حشره¬كشي است كه يك ضد پرتئين توليد مي¬كند. ژن¬هاي Bt، توكسين Bt را كد مي¬كنند، كه داراي طيف وسيعي از فعاليت حشره¬كشي مي¬باشند. اكثر توكسين¬هاي Bt بر عليه لاروهاي بال پولك داران فعال هستند، اما بعضي ها ويژه حشرات راسته دو بالان و قاب بالان هستند. عامل سميت حشره¬هاي Bt يك پروتئين بزرگ مي¬باشد. توكسين¬ها به صورت پروتئين¬هاي كريستالي سيكما توكسين (δ-endotoxins) در درون باكتري در خلال اسپورزايي تجمع مي¬يابند. اين پروتئين¬ها بعد از آلوده كردن حشره حساس، به فرم فعال در مي¬آيند و در نتيجه با اختلال در انتقال يون باعث مرگ حشره مي¬شوند. چندين ژن كه توكسين¬هاي مؤثر بر بال پولك داران را توليد مي¬نمايند، جداسازي شده¬اند. يكي از اين ژن¬ها كه متعلق به B. thuringinesis زير گونه Kurstaki HD-1 مي¬باشد. ژن¬هاي شيمري B. thuringinesis kurstaki داراي پروموتور s35 ويروس CaMV و يك توالي كد كننده براي يك پروتئين تغيير يافته كوتاهتر و فعال همانند ژن كامل، سنتز شده و در گياهان گوجه فرنگي بيان شده¬اند (Fischhoff et al. 1987) مقدار پرتئين حشره¬كش در اين گياهان براي كشتن لاروهاي Manduca sexta، Heliothis virescens، Heliothis zea كافي بود. بررسي نتاج گياهان تراريخت نشان داد كه ژن B. thuringinesis kurstaki به صورت يك ژن غالب مندلي تفكيك مي¬يابد. ژن سمي ديگر از B. Thuringinesis، نژاد Berlkiner 1715 ،كلون شده است. اين ژن يك پرتئين Bt2، 1155 آمينو اسيدي را توليد مي¬نمايد. آناليز سطح بيان يك ژن شيمري مبتني بر Bt2 در گياهان توتون نشان داد كه كيفيت سم و فعاليت حشره¬كشي آن با هم ارتباط دارند (Veack et al. 1987). گياهان توتون تراريخت در برابر تغذيه لاروهاي Manduca sexta محافظت گرديدند. سم Bt براي حشرات مفيد، پستانداران و انسان مضر نيست. اين ژن به صورت يك ژن غالب منفرد تفرق مي¬يابد.
نژادهاي Bt داراي تنوع گسترده¬اي از ژن¬هاي كد كننده اندوتوكسين سيكما (δ-endotoxins) مي¬باشند. گزارشات مربوط به كلون كردن و تعيين توالي اولين ژن كد كننده پرتئين حشره¬كش در سال 1981 منتشر گرديد. تا كنون بيش از 100 توالي ژن پرتئين كريستالي انتشار يافته است. هريك از پروتئين¬هاي كريستالي طيف فعاليت خاصي دارد. بعنوان مثال، پروتئين Cry1Ab در برابر كرم ساقه خوار اروپايي ذرت شديداً فعال است و در هيبريدهاي ذرت Bt كنوني مورد استفاده قرار مي¬گيرد. پرتئين Cry1Ab براي لاروهاي كرم گياهچه توتون و كرم غوزه پنبه شديداً سمي است و در واريته¬هاي پنبه Bt بيان مي¬شود و اين گياهان را در برابر سوسك كلورادوي سيب زميني حفاظت مي¬نمايد.
سيكما- اندوكسين¬هاي Bt به هر دو صورت (اندازه كامل) و (كوتاه شده) به گياهان انتقال داده شده¬اند و مقاومت تائيد شدهاي را در برابر توتون (M.sexta)، آفات گوجه فرنگي Heliothis ( virescens و Helicovera zea) و آفات سيب زميني (Phthorimeae operculella) بوجود آورده¬اند. اولين گياهاني كه توليد شدند، قادر به سنتز پروتوكسين (Protoxin) كامل بودند، اما به دليل بيان ضعيف ژن مقادير كمي دلتا توكسين توليد مي¬شد كه حاصل آن عدم بروز مقاومت و يا مقاومت اندك بود. پيشرفتهاي بيشتر، سرانجام منجر به مطلوب شدن بيان ژن cry در گياهان شد. چند سالي است كه اولين نسل گياهان حشره¬كش براي مقاصد تجاري وارد بازار شده است.

1-2- ژن¬هاي مقاومت منشاء گرفته از ميكروارگانيزم¬هاي ديگر
پروتئين كلسترول اكسيداز (Co) موجود در كشت فيلتر شده Sterptomyces بر لارو شپشك غوزه اثر سميت حاد دارد. اين ژن به گياهان توتون منتقل گرديده است. ژن ايزوپنتيل ترانسفراز (ipt) Agrobacterium tumefaciens يك آنزيم كليدي در مسير بيوسنتز سيتوكينين كد مي¬نمايد. بيان ipt در توتون، گوجه فرنگي توسط يك پروموتور القاء شونده توسط زخم (wound inducible promoter) سبب كاهش تغذيه كرم شاخدار توتون (M. sexta) از برگ¬ها و كاهش بقاي شته سبز هلو شده است.


1-3- ژن¬هاي مقاومت از گياهان عالي
همچنانكه سموم Bt با موفقيت به درون گياهان مهندسي مي¬شوند، تلاش¬هايي نيز در جهت كشف ژنهاي سموم حشره¬كش غير Bt صورت مي¬گيرد. تعدادي از پروتئين¬هاي حشره¬كش غير Bt در احتياجات غذايي حشرات مداخله مي¬نمايند. دو گروه عمده از ژنهاي با منشاء گياهي وجود دارد كه براي ايجاد مقاومت به حشرات در گياهان زراعي از طريق به تاخير انداختن رشد و نمو حشره مورد استفاده قرار مي¬گيرند.

1-3-1- بازدارندههاي پروتئيناز (Proteinase inhibitors)
از سال 1938 مشخص شده است كه گياهان داراي پپتيدهايي هستند كه به عنوان بازدارنده¬هاي پروتئيناز عمل (PIPs) مي¬نمايند. پروتئينازهاي مختلف عبارتنداز پروتئينازهاي سرين، سيستئين، آسپارتيك و متالو. پروتئينازها آزاد شدن اسيدهاي آمينه از پروتئين جيره غذايي را كاتاليز مي¬نمايند، و به صورت مواد مغذي ضروري براي رشد و نمو حشرات را تامين مي¬نمايند. بازدارنده¬هاي پروتئيناز با مداخله در عمل آنزيمهاي هضمي حشره، آن را از مواد مغذي ضروري محروم مي¬سازند. به دو نمونه از ژن بازدارنده پروتئيناز در ذيل به آنها اشاره شده است:

الف) بازدارنده ترپسين لوبيا چشم بلبلي (CpTI) (Cowpea trypsin inhibitor gene)
CpTI كه در لوبيا چشم بلبلي (Vigna unguiculata) يافت مي¬شود، فعالترين بازدارنده¬اي است كه تاكنون شناسايي شده است. اين ژن بازدارنده مواد آنتي متابوليتي توليد مي¬نمايد كه سبب محافظت در برابر سوسك ( Callosobruchus maculates)كه يك آفت انباري اصلي است، مي¬شود. علاوه بر اين، اين ژن همچنين براي حشرات متعددي از خانواده بال پولكداران (Heliothis virescens)، ( Manduca sexta) قاب بالان (Callosobruchus، Antonomous grandis) و راست بالان (Locusta migratoria) مضر است، اما براي پستانداران بيضر مي¬باشد. ژن CpTI كلون شده و ساختارهاي حاوي پروموتور S35 ويروس CaMV و يك كلون cDNA با طول كامل bp550 از آن براي تراريخت نمودن ديسكهاي برگي توتون مورد استفاده قرار گرفت. آزمايش سنجي براي فعاليت حشره¬كشي گياهان توتون تراريخت با كرم غوزه پنبه (Heliothis zea) انجام شد. بقاء حشره و ميزان خسارت وارده به گياه، در گياهان تراريخت در مقايسه با گياهان شاهد، بطور واضحي كاهش يافت.

ب) بازدارنده آلفا – آميلاز (α-amylase inhibitor)
سه ژن بازدارنده آلفا- آميلاز در توتون بيان شده¬اند، اما تاكيد اصلي بر روي انتقال ژن بازدارنده آلفا – آميلاز (AI-Pv) α جدا سازي شده از لوبيا ( Phaseolus vulgaris) بوده است. اين ژن بر عليه Zabrotes subfaciatus و Callosobruchus chinesis عمل مي¬نمايد. اين پروتئين بازدارنده آلفا- آميلاز، تغذيه لاروي را در بخش مياني لوله گوارش را بلوكه مي¬نمايد. لوله گوارش لارو يك آنزيم آلفا-آميلاز ترشح مي¬كند كه نشاسته را هضم مي¬نمايد. با اضافه كردن يك پروتئين، كه آلفا- آميلاز روده حشرات را متوقف نمايد، شپشه دچار گرسنگي شده و مي¬ميرد.

1-3-2- لكتين¬ها (Lectins)
لكتين¬ها خانواده بزرگ ديگري از پروتئين¬ها هستند كه مي¬توانند بعنوان سموم ضد حشره براي مهندسي ژنتيك مقاومت به حشرات مورد استفاده قرار گيرد. لكتين¬ها گليكوپروتئينهاي گياهي هستند. توجهات اخير بطور عمده بر روي لكتين Galanthus nivalis كه به GNA نيز معروف است، متمركز شده است، زيرا كه فعاليت ضد شته از خود نشان مي¬دهد. ژن اين پروتئين، با موفقيت در مطالعات مهندسي ژنتيك مورد استفاده قرار گرفته و در گونه¬هاي گياهي مختلفي همچون سيب زميني، و گوجه فرنگي بيان شده است. آزمونهاي آزمايشگاهي با سيب زميني تغيير يافته نشان داد كه GNA، مرگ و مير را افزايش نمي¬دهد، اما سبب كاهش قابل ملاحظه¬اي در باروري مي¬شود. يك ويژگي مهم اين پرتئين اين است كه بر عليه حشرات مكننده و نفوذ كننده نيز عمل مي¬نمايد. با اين وجود، يك عيب آن اين است كه اين پرتئين زماني خوب عمل مي¬كند كه به مقادير فراواني بلعيده شود، يعني زمانيكه حشره در معرض مقادير ميكروگرمي اين پروتئين در آزمايشات زيست سنجي در جيره غذايي قرار داده مي¬شود. بنابراين، اگر چه كه چند ژن كد كننده لكتين (آگلوتينين جنين گندم و لكتين برنج ) در گياهان تراريخت بيان شده¬اند، ولي تاثير حشره¬كشي آنها بسيار كمتر از آن است كه مؤثر واقع شوند.

1-4- ژنهاي مقاومت از حيوانات
ژنهاي مقاومت مورد نظر ترجيحاً بازدارنده¬هاي پروتئيناز سرين از پستانداران و كرم شاخدار توتون Manduca sexta مي¬باشد. بر اساس غربالگري در اين¬ويترو بازدارندگي از پروتئوليز توسط عصاره¬هاي تعدادي از لاروهاي بال پولك¬داران، بازدارنده ترپسين پانكراسي بواين (BPTI)، آلفا- آنتي ترپسين (α.AT) و بازدارنده اسپلين (SI)، بعنوان پروتئين¬هاي اميد بخش مقاومت به حشرات شناسايي و به تعدادي از گياهان منتقل گرديده¬اند. معذالك نتايج اوليه بر روي بيد سيب زميني در گياهان سيب زميني تراريخت، چندان رضايتبخش نيست. اما بازدارنده¬هاي پروتئيناز گرفته شده از Manduca sexta يعني آنتي كيميو ترپسين (Anti-chymiotrypsin) و آنتي الاستاز (Anti- elastase) بيان شده در پنبه و كتيناز (Chitinase) در توتون، توليد مثل را به ترتيتب در Bemisia tabaci و Heliothis virescens كاهش دادند، تعدادي از ژنهاي عامل مقاومت به حشرات كه براي توليد گياهان تراريخت مورد استفاده قرار گرفته¬اند.

2- مقاومت به ويروس
به دليل اندازه نسبتاً كوچك ژنوم ويروس¬هاي گياهي، توسعه راهكارهاي مولكولي براي كنترل بيماريهاي ويروسي گياهي به طور خاص موفق بوده است. راهكارهاي مختلفي براي استفاده از تكنولوژي مولكولي به منظور تلفيق يا ايجاد فاكتورهاي مقاومتي جديد در سيستمهاي ويروسي گياهان وجود دارد. روال كار به اين نحو است كه¬آن دسته از محصولات ژن يا ژنهاي ويروسي شناسايي شوند كه وقتي در زمان نامناسب يا با مقدار نادرست وجود دارند، با كاركردهاي نرمال فرايند آلودگي مداخله نموده و مانع از پيشرفت بيماري شوند.

2-1- حفاظت متقاطع به واسطه پروتئين پوششي
مفهوم حفاظت متقاطع به توانايي يك ويروس براي جلوگيري يا بازدارندگي اثر رقابتي ويروس ديگر اطلاق مي¬شود. اگر نژاد حساس از يك گياه زراعي با نژاد ملايمي از يك ويروس تلقيح شود، نژاد حساس گياه زراعي نسبت به نژادهاي بيماريزاتر ويروس مقاوم مي¬شود. براي اولين بار پاول آبل و همكاران (1986) نشان دادند كه توتون تراريخت بيان كننده پروتئين پوششي ويروس موزائيك توتون (TMV) مقاومتي شبيه به مقاومتي كه در حفاظت متقاطع به واسطه ويروس اتفاق مي¬افتد، نشان مي¬دهد. از آن زمان به بعد، تعدادي از ژنهاي پوشش پروتئيني از گروههاي ويروسي متفاوت پيدا شده¬اند كه وقتي در گياهان تراريخت بيان مي¬شوند، مقاومت ايجاد مي¬كنند. مقاومت به واسطه پروتئين پوششي در صورت كاهش تعداد مناطق آلودگي روي برگهاي تلقيح شده عمل مي¬كند، بيانگر اين كه يك مرحله اوليه در سيكل زندگي ويروس مختل شده است.
مطالعات نشان داده است كه حفاظت متقاطع TMV ممكن است از پروتئين پوششي ويروس محافظت كننده ناشي شود كه مانع از حذف پوشش از RNAهاي ويروس رقيب مي¬شود. اكثر سيستمهايي كه در آنها مقاومت به واسطه پروتئين پوششي گزارش شده است، بر عليه ويروسهاي RNAاي پلاس- سنس با يك پروتئين كپسيد بوده است. اين راهكار در چند محصول زراعي از قبيل توتون، گوجه فرنگي، سيب زميني، يونجه، هندوانه، كدو، برنج، ذرت و غيره استفاده شده است .
يك ويروس رشته منفي مهم، ويروس پژمردگي لكه¬اي گوجه فرنگي (Nucleocapsid protein) پيوند خورده است. اين پرتئين در بسته¬بندي RNA ويروسي و همچنين در تنظيم مراحل رونويسي تا همانندسازي در طي سيكل آلودگي، فعاليت مي¬نمايد. با استفاده از اين روش گياهان تراريخت در توتون و گوجه فرنگي توليد شده¬اند.

2-2- مقاومت به واسطه پروتئين غير ساختماني (Non-structural protein mediated resistance)
ويروس¬ها، پروتئينهاي غير ساختماني را كد مي¬كنند كه براي همانند سازي ضروري مي¬باشند. اخيراً تعدادي از اين پروتئينهاي غيرساختماني رپليكاز (Replicase) كشف شده است كه وقتي در گياهان تراريخت بيان مي¬شوند، درجات بالايي از مقاومت به آلودگي ويروس را ايجاد مي¬نمايند. گلمبوسكي (Golemboski) و همكاران در سال 1990، براي اولين بار اين پديده را به بيان چهارچوب قرائت باز 54 كيلو دالتوني ويروس TMV در توتون تراريخت نشان دادند. توتون تراريخت مقاوم به قهوه¬اي شدن زودرس (PEBV) و سيب زميني مقاوم به ويروس x (PVX) توليد شد.

2-3- مقاومت به واسطه سنس (sense) و آنتي سنس (Antisense)
استراتژي ديگر الگو گرفته از پاتوژن كه براي كنترل ويروس¬هاي گياهي مورد بررسي قرار گرفته است، بيان ترانسژن آنتي سنس و جديداً قطعات سنس RNAهاي ويروسي مي¬باشد. اساس اين راهكار، اتصال RNAي ويروسي با توالي هاي RNA مكملي است كه توسط گياه بيان مي¬شوند. جفت شدن نامناسب RNA-RNA، از در دسترس بودن RNA ويروسي براي همانند سازي و بيان ژن، ممانعت مي¬نمايد. بنابراين ساختارهاي آنتي سنس و سنس مي¬توانند براي بلوكه كردن مراحل اوليه مهم كه در ايجاد آلودگي ويروسي مهم هستند، مورد استفاده قرار گيرند. حفاظت آنتي سنس، در توتون كه RNAي مكمل پروتئين پوششي ويروس را بيان مي¬كند نشان داده شده است.

2-4- حفاظت با RNAي ماهواره¬اي (Satellite RNA protection)
RNAهاي ماهواره¬اي، گروهي از RNAهاي تك رشته¬اي كوچك (تقريباً 300 نوكلئوتيد) هستند كه براي همانندسازي و بسته¬بندي ويريوني به منظور ايجاد آلودگي در جاي ديگر، به يك ويروس هم دست (Virus Helper) وابسته مي¬باشند. بنابراين RNAي ماهواره¬اي براي تكثير و انتقال به ويروس وابسته است، اگرچه وابسته به ژنوم ويروس نيست. اين گونه RNA ماهواره¬اي با چندين ويروس ديگر مرتبط هستند. تعدادي از RNAي ماهواره¬اي تكثير و علايم ويروس هم¬دست خود را تعديل مي¬نمايند. بسته به RNAي ماهواره¬اي مرتبط، طيف تغيير در ايجاد علايم از نكروز شديد تا كم اثر شدن كامل آن مي¬باشد. بنابراين RNAهاي ماهواره¬اي كه علايم را تقليل مي¬دهند مي¬توانند بطور بالقوه براي كاهش شدت بيماري ويروس ياريگر مورد استفاده قرار گيرند. بدين جهت، كاربرد آن در گياهان تراريخت براي ايجاد مقاومت در گياهان زراعي از جايگاه مهمي برخوردار گرديده است. تاين و همكاران (1987) و تاين و گوسوي (1991) نشان دادند كه تلقيح عمدي يك نژاد ملايم ويروس موزائيك خيار (CMV) حاوي يك RNAي ماهواره¬اي تقليل دهنده علائم، گياهان توتون، فلفل، گوجه فرنگي و خيار را بطور موفقيت آميزي در برابر يك نژاد بيماريزاي CMV محافظت نمود و ميزان خسارت را كاهش داد.
تاين و گوسوي (1991) گزارش كردند كه 121 گياه گوجه فرنگي تراريخت بيان كننده يك RNAي ماهواره¬اي تقليل دهنده علائم CMV، در مقايسه با گياهاني كه يك نژاد قوي CMV به آنها تزريق شد، 50% عملكرد بيشتري توليد كردند. اين راهكار مربوط به آن دسته از سيستم¬هاي ويروسي است كه داراي RNAي ماهواره¬اي تقليل دهنده هستند. كلن و همكاران (1997)، فلفل¬هاي قرمزي (Capsicum annum) توليد كردند كه RNAي ماهواره¬اي CMV را بيان مي¬نمودند. كاهش علائم آلودگي ويروسي در نتاج اين گياهان، پس از تلقيح با نژادهاي CMV-Y يا CMV-Korea، تائيد گرديد.

3- مقاومت به بيماري
تا كنون تعداد زيادي از ژن¬هاي پاسخ دفاعي گياهان كه پروتئين¬هاي ضد ميكروبي را كد مي¬نمايند، كلون شده¬اند. اكثر اين ژن¬ها در پاسخ به آلودگي و يا در مواجهه با ماكرومولكول¬هاي ميكروبي در سطح نسخه¬برداري فعال مي¬شوند. فراورده¬هاي ژن¬هاي پاسخ دفاعي مي¬تواند شامل (1) آنزيم¬هاي هيدروليتيك نظير كتيناز، 1,3,β-D glucanase و ديگر پروتئين¬هاي مرتبط با بيماريزايي (PR) (pathogenesis related protein)، (2) پروتئين¬هاي غيرفعال كننده ريبوزوم (RIPs)، (3) پروتئين¬هاي ضد قارچ ( AFPs)، (4) آنزيم¬هاي بيوسنتزي براي توليد فيتوالكسين هاي ضد ميكروبي، (5) فنوليكهاي متصل به ديواره، اسموتين¬ها (osmotins)، تيونين¬ها(thionins) و (6) پراكسيد هيدروژن، باشد.

3-1- پروتئينهاي مرتبط با پاتوژن
اين پروتئين¬ها داراي وزن مولكولي كم بوده و به مقادير قابل توجهي در بافت¬هاي گياهي آلوده تجمع مي¬يابند. گروه¬هاي اصلي پروتئين¬هاي PR عبارتنداز PR-1، PR-2 ( 1و3- بتا گلوكاناز)، PR-3 (كيتينازها)، PR-4 (شبه Heveine) و PR-5 (اسموتين و شبه تائوماتين) در توتون. براي ايجاد مقاومت به پاتوژن¬ها در گياهان زراعي از توانايي آنزيم¬هاي هيدروليزكننده در شكستن كيتين و گلوكان ديواره سلولي قارچهاي پاتوژن استفاده شده است.
ژن¬هاي كيتيناز متعددي از گياهان جداسازي شده و توصيف گرديده¬اند. اولين گزارش در توتون بود كه يك ژن كيتيناز باكتريايي بدست آمده از باكتري خاكزي Serratina marcescens، بطور پايدار تلفيق و در برگهاي توتون بيان گرديد (Jones et al. 1988). يك ژن كيتيناز اصلي از Phaseolus vulgaris تحت كنترل پروموتور ساختماني قوي s35 ويروس CaMV، بطور ساختماني و به مقدار زياد در گياهان تراريخت توتون و Brassica napus بيان شد (Broglie et al. 1991). اين بيان، منجر به حفاظت قابل ملاحظه گياهان از قارچ پاتوژن Rhizoctonia solani گرديد كه باعث مرگ گياهچه پس از جوانه زني مي¬شود. در مورد B.napus، اگر چه حفاظت مدنظر به صورت تاخيري بود تا ممانعت كامل از بروز علائم، با اين حال نتايج بدست آمده نشان داد كه سطح حفاظت به اندازهاي هست كه از اهميت افتصادي در شرايط مزرعه برخوردار باشد.
هيچ گزارشي در مورد افزايش مقاومت ناشي از بيان ژن 1-3-β-D-glucanase به تنهايي در گياهان تراريخت وجود ندارد، اما ژن گلوكاناز وقتيكه با كيتيناز همراه مي¬شود، مقاومت به قارچ را در توتون، گوجه فرنگي و هويج نشان مي¬دهد.

3-2- پروتئين¬هاي ضد ميكروبي (Anti-microbial proteins)
گياهان و ديگر موجودات ممكن است داراي پروتئين¬هاي ضدميكروبي باشند كه ضرورتاً در ارتباط با پاسخ دفاعي القا شده نيستند، اما وجود اين پروتئين¬ها سبب بروز مقاومت به پاتوژن¬ها مي¬شود.اين پروتئين¬ها شامل پروتئين¬هاي غيرفعال كننده ريبوزوم (RIPs)، پروتئين¬هاي غني از سيستئين مانند لكتين¬ها، دفنسين¬ها، تيونين¬ها، ليزوزايم، بازدارنده¬هاي پلي گالاكتوروناز و غيره مي¬باشد. گياهان تراريخت مقاوم به پاتوژن¬ها در گونه¬هاي متعددي توليد شده¬اند.

3-3- فيتوالكسين¬ها
فيتوالكسن¬ها، متابوليت¬هاي ثانويه¬اي با وزن مولكولي كم و با فعاليت ضد ميكروبي هستند كه توسط گياهان در پاسخ به يك آلودگي سنتز مي¬شوند و در مقاومت گياهان به بيماري سهيم مي¬باشند. در طي آلودگي، فيتوالكسين¬ها ذخيره شده ( معمولاً در سلول يا اندامك¬هاي خاص ولي به فرم كانژوگه غيرفعال وجود دارند) به جنبش در آمده و همزمان ژن¬هاي مسيرهاي بيوسنتزي آنها فعال مي¬شوند و سنتز فيتوالكسين¬هاي بيشتري شروع مي¬گردد. رسوراتزول (Resveratoral) يكي از معمول¬ترين استيلبن¬ها (Stilbene) (فيتوالكسين¬ها) است كه در بعضي از گونه¬ها سنتز مي¬شود. آنزيم اصلي در سنتز رسوراتزول، آنزيم رسوراترول سنتاز (Resveratrol synthase) است كه غالباً به استيلبن سنتاز (Stilbene synthase) معروف مي¬باشد.
هين و همكاران (1990) نشان دادند كه انتقال يك ژن استيلبن سنتاز (STS) از بادام زميني به توتون سبب توليد مقادير قابل اندازه¬گيري از رسوراترول استيلبني بادام زميني در توتون مي¬شود و اثر سميت ضدقارچي رسوراترول در گياهان را اثبات نمودند. ژن STS به برنج و Brassica napus نيز منتقل شده است.

3-4- دستورزي ژن¬هاي مقاومت به بيماري
تلاش¬ها در زمينه جداسازي ژن¬هاي مقاومت به بيماري، به لطف توسعه روش¬هاي كلونينگ مبتني بر نقشه وعلامتگذاري ژن در چند سال گذشته به پيشرفت قابل توجهي نائل گرديده است. ژن HM1 ذرت، كه مقاومت به Cochliobulus carbonum اعطا مي¬كند با استفاده از علامت¬گذاري ترانسپوزون (transposon tagging) كلون شده است (Johal and Briggs 1992). اين ژن آنزيم HC- توكسين رودكتاز (HC-toxin reductase) وابسته به NADPH را كد مي¬نمايد كه سم قارچي HC را غيرفعال مي¬سازد. ژن¬هاي مقاومت نظير RPs2 و RPM1 از آرابيدوپسيس، Pto،Cf9، Cf4 و Cf2 از گوجه فرنگي، ژنN توتون، L16 كتان و Xa21 برنج كلون شده¬اند. تعدادي از ژن¬هاي غيربيماريزا شامل Avr9، Avr4 و غيره نيز كلون گرديده¬اند.
انتقال ژن مقاومت (R) از يك واريته گياهي مقاوم به يك پاتوژن خاص به واريته حساس، يك راهكار اصلاحي است. مارتين و همكاران (1993)، گياهان گوجه فرنگي با ژن مقاومت Pto توليد نمودند كه به seudomonas syringae pv. tomato مقاومت ايجاد مي¬نمايد. گياهان توتون تراريخت براي Pto، به Pseudomonas syringae pv. tabaci بيان كننده avrPto مقاوم شدند. ژن Xa21 برنج به بيش از 30نژاد مختلف باكتري Xanthomonas oryzae عامل بادزدگي برگ برنج مقاومت ايجاد مي¬نمايد. سانگ (Song) و همكاران (1995) گياهان تراريخت برنج مقاوم به Xanthomonas بيان كننده avrX21 را توليد نمودند.

مقاومت به تنش¬هاي غيرزنده
تقريباً تمام تنش¬هاي غيرزنده نظير خشكي، سرما و شرايط قليايي اثر منفي بر رشد داشته و سبب القاء پيري، مرگ سلولي و يا كاهش عملكرد گياه مي¬شوند. تعدادي از تنش¬هاي غيرزنده همچون خشكي، شوري و دماي خيلي بالا و يا خيلي پائين دراي پيامد مشتركي يعني كمبود آب سلولي و يا تنش اسمزي مي¬باشد. از اين¬رو، پاسخ گياهان به كمبود آب، سنتز و تجمع تركيباتي با وزن مولكولي كم بنام حفاظت كننده¬هاي اسمزي (Osmoprotectants) است. اين حفاظت كننده¬هاي اسمزي، پتانسيل اسمزي درون سلول¬ها را كاهش داده و به حفظ تورژسانس سلولي كمك مي¬نمايند. محلول¬هاي سازگار شامل گروه متنوعي از تركيبات متعددي از قبيل يونهاي غيرآلي، يونهاي آلي، كربوهيدراتهاي محلول شامل پلي ئولها (Polyols) ( قندها، الكلها)، اسيدهاي آمينه (پرولين) و تركيبات آمونيوم چهارگانه نظير گلايسين بتائين را در بر مي¬گيرند. چندين ژن گياهي كه آنزيم¬هاي كليدي مسيرهاي بيوسنتزي اسموليت¬هايي همچون الكلها، قندها، گلايسين بتائين و پرولين را كد مي¬نمايند كلون شده¬اند.
همبستگي شديدي بين تجمع پرولين با تحمل به شرايط تنش خشكي و شوري گزارش شده است. گاما- پيرولين- 5- كربوكسيلات سنتتاز (P5CS) (γ-pyrroline-5- carboxylate synthethase)، آنزيم محدود كننده سنتز پرولين است. گياهان توتون تراريخت با آنزيم P5CS توليد شدند كه بيان بالايي از اين آنزيم و 18-10 برابر پرولين بيشتر را نشان دادند. افزايش غلظت پرولين با افزايش رشد در شرايط خشكي و شوري همبستگي داشت (Kishore et al. 1995). توانايي سنتز و تجمع گلايسين بتائين يكي از قابليت¬هاي گسترده بازدانگان است كه در تحمل به خشكي و شوري نقش دارد. سنتز گلايسين بتائين در گياهان توسط اكسيداسيون دو مرحله¬اي كولين (Choline) از طريق بتائين آلدئيد ( ماده واسط) صورت مي¬گيرد. اين واكنش توسط كولين مونواكسيژناز (CMO) (Choline monooxygenase) و بتائين آلدئيد دهيدروژناز (BADH) كاتاليز مي¬شود. گياهان تراريخت توتون، آرابيدوپسيس و برنج با BADH، افزايش مقاومت به شوري را نشان دادند. يك ژن باكتريايي E.coli بنام mt1D كه در بيوسنتز مانيتول سهيم است به توتون انتقال داده شد و گياهان تراريخت توليد كننده مانيتول، ارتفاع ساقه بيشتر و انشعابات ريشه¬اي جديد و طويل¬تري داشتند، در حاليكه ريشه¬هاي گياهان شاهد قهوه¬اي شده و طويل شدن يا منشعب شدن در آنها رخ نداد. اگرچه بهبود مقاومت در حدي نبود كه قابل كاربرد در كشاورزي باشد، ولي اين اولين مثال از يك گياه تراريخت با ژن ميكروبي بود كه مقاومت بيشتري را به تنش¬هاي اسمزي نشان داد ( Traczynski et al. 1993). تغيير ديگري در مقاومت به تنش اسمزي، در گياهان توتون مهندسي شده براي بيان يك ژن باكتريايي كه در بيوسنتز فروكتان (Fructan) نقش دارد، گزارش شده است (Pilons-Smith et al. 1995). گياهان تراريخت ذخيره كننده فروكتان، وقتي¬كه با تنش خشكي با استفاده ار 10% PEG در كشت هيدروپونيك مواجه گرديدند، سرعت رشد سريعتري را نشان دادند. تنش اسمزي، تجمع مجموعه¬اي از پروتئينهاي با وزن مولكولي كم بنام پروتئين¬هاي محافظ (Dress proteins) نظير LEAها را در بافت¬هاي گياهي تحريك مي¬نمايد. يك ژن lea از جو بنام HVAI حفاظت از تنش را در برنج تراريخت نشان داد (Xu et al. 1996).

مقاومت به علفكش
كاربرد علفكش¬ها براي كنترل علفهاي هرز در كشاورزي مدرن نقش بسزايي دارد. تلاش¬هاي زيادي در چندين آزمايشگاه براي مهندسي گياهان مقاوم به علفكش صورت گرفته است. در مقاومتي كه توسط يك ژن كنترل مي¬شود پيشرفت حاصل شده است. براي ايجاد گياهان مقاوم به علفكش سه راهكار مورد استفاده قرار گرفته است: (1) توليد بيش از حد هدف بيوشيميايي حساس به علفكش، (2) تغيير ساختماني هدف بيوشيمايي بطوري كه منجر به كاهش اثر گذاري علفكش شود و (3) سميت زدايي و تجزيه علفكش قبل از رسيدن آن به هدف بيوشيميايي درون سلول گياهي.

گروه : ژنتیک-بیوشیمی گیاهی-تشریح ورده بندی -فیزیولوژی گیاهان

 قسمت اول

-- -